技术文章8 上游工艺细胞培养放大需求和挑战

　几种常见的悬浮培养和放大工艺方式，分别是批次式培养、流加（补料）式培养基灌注式培养。批次式培养是指在生物反应器中一次性加入细胞培养基和接入细胞种子，在培养过程中除了调节培养环境的PH值和溶氧外，不补充培养基也不排出培养基，直至培养过程结束。批次式培养的生长代谢环境相对是一个固定环境，不添加任何营养成分，能够观察细胞.
 
细胞生长整个代谢过程。但由于初始营养物质比较丰富，可能会造成细胞早期过量利用，进而积累大量的代谢废物，培养后期细胞生长易受到抑制，生长周期较短，细胞密度也不高。流加（补料）式培养是指，细胞培养基不是一次性加入反应器中，而是根据细胞生长代谢的情况逐步补加营养成分，维持葡萄糖、谷氨酰胺等关键营养物质，来维持合适的平衡浓度，避免培养过程中出现营养限制和有毒代谢产物过量积累，以达到延长细胞培养时间，增加细胞密度和提高产物浓度的目的。灌注式培养是指将细胞和细胞培养基一起加入反应器中后，在细胞生长和产物形成过程中，不断的流加新鲜培养基，同时通过细胞截留装置排除培养上清，而活细胞被截留在反应器中的一种操作方式。培养基的不断流出，可带走代谢副产物如乳酸、氨等，使其在培养液中维持低浓度水平，避免成为细胞生长的抑制因素，使细胞生长在良好的培养环境中，最终能获得较高的细胞培养密度和产物生产速率。因此，灌注式培养具有反应体积小，回收体积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温条件下保存，有利于保持产品的活性等特点，一般在小规模生物反应器的条件下应用比较多。不足之处是其操作流程比较复杂，细胞培养基利用率低，工艺放大过程较为困难，细胞截留装置存在截留效率和堵塞等问题。


搅拌速率和通气策略作为相对关键的体积依赖性的参数，在放大培养过程中会变为公认的难题。由于各型反应器的搅拌方式、罐体设计和性能设计均有不同，因此，很难建立统一或者通用性的放大模型。所以，需要从几个方面进行全方面的考量。搅拌策略和通气策略要相互配合，一方面通过适当的搅拌可以促进培养基中的营养物质充分混合，加强气液传质的效果，达到理想的培养环境；另一方面，在有效的的供给氧气传质的同时，也可以一定程度上帮助排除溶解于培养液中的二氧化碳，保证二氧化碳分压的正常。不过，过高的搅拌转速和过大的气体通气量，往往会带来一定的剪切力，在一定程度上可能会对细胞的培养带来负面的影响。针对细胞培养放大过程中几个常见因素，进行简单介绍。


1、氧气的传质
氧气是细胞生存必不可少的条件之一，细胞主要利用的是溶解在细胞培养液中的氧。气体中的分子态氧溶解在水中称为溶解氧，简称溶氧，是表征水溶液中氧浓度的参数。溶氧也能在一定程度上反映细胞的生理代谢变化和对产物合成的影响，细胞在不同的生长阶段对于氧的需求也有所不同。氧气的供给和传质是细胞培养过程中一个重要环节，稳定的溶氧水平，是维持细胞正常的重要因素。通常情况下，哺乳类动物细胞，都需要30%-40%的溶氧水平。利用搅拌式的生物反应器，对于较大规模或较高密度的细胞培养来说，细胞对于氧气的消耗速率较快，氧气需求量很大，通常会采用通过微泡分布器通气方式来维持较强的氧气传质。微泡分布器，作为微米级的气体分布器，是通过增加气泡的表面积来提高氧气传质系数。另外，大泡分布器，作为毫米级气体分布器，能够带来较大的通气量 ，同时可以辅助气体的排除，因此常用来通入空气以排除二氧化碳。通过有效的PH值以及溶氧值监测调控，配合泵系统的整体控制，可以给细胞提供优良的生长环境。与此同时，随着培养体积的增大，反应器体积的增加以及混合时间的明显增加，有可能带来反应器内部溶氧水平呈阶梯化分布。一般来说，溶氧水平的改变可能会影响细胞的代谢水平，如果较为显著的改变还可能影响蛋白的糖基化水平，对于产品质量有所影响。因此，对于反应器搅拌效率的考量也是一个较为关键的因素。


2、PH和CO₂的控制
PH作为一个重要的工艺参数及控制参数，往往也会直接影响细胞表达产物的质量。PH的控制和调节在整个细胞培养的过程中是一个动态的过程。起始阶段，接种前，接入新鲜培养基时，通常需要让培养基平衡一下，如果PH数偏碱性的话，可以适量通入二氧化碳来平衡PH，为接种细胞做准备。培养过程中代谢的乳酸和通气中的二氧化碳，会使培养液中的PH一定程度的下降，因而需要补充碱液（例如NaHCO₃ 、NaCO_3等）来实现一个有效的调节。对于碱液浓度的选择及补碱液的位置也很重要，如果造成局部PH过高，有可能会导致细胞裂解，影响培养结果，因此，通常情况下，会选择低浓度的碱液来进行控制。由于是外加的溶液，也要考虑渗透压的影响，应尽可能的降低碱液对渗透压的增加，同时需平衡对二氧化碳分压的控制。二氧化碳的控制，在放大培养过程中，二氧化碳的排除一直是较为麻烦的环节。二氧化碳相对于氧气而言，在液体中的溶解度比较高。细胞每消耗一份子氧气，便会产生一份子二氧化碳，经过一段时间的积累，二氧化碳的浓度会上升。当反应器中单位二氧化碳浓度达到15%-20%时，会对细胞产生毒害作用，因此一般会加入一定量的NaHCO₃作为缓冲体系。但当二氧化碳浓度远超过缓冲体系的缓冲能力时，就需要考虑利用通气量、气泡尺寸等多种因素共同控制，从而有效地排除二氧化碳。实践证明，增大深层通气量或使用大泡分布器可以显著降低二氧化碳分压，而改变搅拌转速或者增加表层通气量对二氧化碳分压影响较小。


3、混合效果
与混合效果较为相关的两个部分分别为，通过搅拌混合达到气体与液体的充分接触，并形成稳定的气体传质；通过搅拌混合使得液体中的有效成分浓度在整个体系中呈均匀分布，从而达到一个稳定的液体培养环境。为了实现良好的混合效果，对于反应器的整体设计有一定的要求。对于较大体积生物反应器来说，其目的都是为了能够实现整体培养环境中的稳定和均一。另外一个决定混合效果的因素书搅拌方式。上搅拌、下搅拌、有无轴封、斜搅拌、直搅拌等，不管选择哪种方式，最终的目的是在尽可能少的对细胞造成损伤的前提下，最大程度提供有效的搅拌效果。采用不同形状的搅拌桨会带来搅拌的差异性，不同形式的搅拌均有对于搅拌效果的测试，依据实际需求可以做出选择。


4、剪切力
  一般在细胞培养过程中提到的剪切力按照来源大致可以分为两类：搅拌相关和通气相关。搅拌相关的剪切力主要指由于搅拌桨运动所产生的流体剪切力，可能会对细胞产生一些物理性的损伤，严重的可能会导致细胞死亡。也有实例中发现，流体剪切力可能会对抗体的糖基化水平有一定的影响。不过通常来说，细胞反应器内的平均能耗还是相对比较低的，排除一些物理性的因素之外（如搅拌轴自身材质或设计），流体剪切力对于细胞的影响还是比较小的。
关于通气相关剪切力，根据气泡的形成周期来分析，可能对细胞的造成影响可简单分成四个阶段：气体分布器处气泡的形成；搅拌桨处气泡的合并与碰撞破裂；反应器内气泡上升；气液交换处或接触面气泡的碰撞破裂。根据实际经验，气液交界面气泡破裂是导致细胞损伤的剪切力的主要来源，其他方向相对来说影响较小。采用不同孔径的气体分布器以及改变分布器与搅拌桨的相对位置也会带来不同影响，具体问题需要具体分析。
 
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