BioWill?系列生物反应器生产贝伐珠单抗工艺探索

　 1.1 工程细胞的制备
        将重组全人源抗CD20单克隆抗体基因转入宿主细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO-S），经过筛选、鉴定，得到重组工程细胞。细胞库的建立、传代及保存、细胞检定均符合《中国药典》现行版“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”的规定。
细胞复苏后于36.5℃、6% CO2、130 r/min条件下培养，细胞冻存1.5ml/支于液氮或-130℃以下保存。细胞外源因子检查应为阴性，细胞为圆形，悬浮生长，倍增时间为16～40 h；采用同工酶图谱分析和染色体特征分析，应与CHO细胞相同；细胞库应与CHO具体相同成瘤性特征；表达产物应有生物学活性；目的基因核苷酸序列应与理论设计序列一致。
 
1.2 原液的制备
 
1.2.1 细胞复苏与摇瓶种子扩增
 
从液氮罐中取出 1 支冻存的工作细胞库细胞， 37℃水浴复苏后，用种子培养基接种至摇瓶中，于 130 rpm、36.5℃、6% CO₂ 条件下培养，培养2～4天后进行细胞传代扩增，直至细胞数量满足WAVE培养的要求。
 
1.2.2 BioWill™Wave反应器种子培养
 
将摇瓶种子接种入种子培养基中，培养条件为36.5±0.5℃、摇动角度8º、摇动速度18 r/min、表通90～95%空气和10～5% CO2。当WAVE 反应器内细胞密度达到 2×10⁶cells/mL~5×10⁶cells/mL，活率90%以上时，进行 50 L 生物反应器接种。
 
1.2.3 BioWill™SUS50 L生物反应器种子培养
将wave种子接种入种子培养基中，培养条件为36.5±0.5℃、pH 7.0±0.1、DO 20%～80%、转速70～100 r/min。当反应器内细胞密度达到 2×10⁶cells/mL~5×10⁶cells/mL，活率90%以上时，进行下一步流加培养。
 
1. 2.4  BioWill™SUS 250 L生物反应器种子 流加培养
 
按照0.8～1.2×10⁶cells/mL的密度接种，前期细胞生长期培养温度为36.5℃，搅拌速度70～150 r/min，DO 40%，pH 6.95±0.15，当细胞进入后期表达期时进行降温至33℃。
 
从培养第3天开始，将总量为初始培养体积20%的流加培养基进行连续性流加。每天取样，监测各培养参数和生化指标，当葡萄糖浓度低于2.5 g/L时，补加葡萄糖浓缩液使葡萄糖浓度提高至4 g/L。当泡沫高于液面5 cm时，补加消泡剂稀释液。细胞培养周期为 12～15天。
 
1.2.4 收获
 
待细胞培养结束后，收获上清液至下游纯化。
 
 
1.2.5  纯化
 
工艺流程图如下：
  1.2.5.1 澄清过滤
      采用millipore的两级深层过滤膜包（D0HC和X0HC）以及Sartorius的除菌过滤器对收获液进行澄清过滤，过滤完成后用平衡缓冲液冲洗膜包。
1.2.5. 2 亲和层析
 
采用GE的Mabselect SuRe填料，用亲和平衡缓冲液（20mM Tris-150mM NaCl，pH 7.2）冲洗层析柱5CV，待基线平稳后调零上样，上样完毕后用亲和平衡缓冲液冲洗5CV；用亲和洗脱缓冲液（100mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH 3.5）开始洗脱，收集紫外280nm处的主峰，收集液用2 M Tris调pH至6.5±0.3，除菌过滤2～8℃保存。
 
1.2.5.3 低pH病毒灭活
       将亲和收集液用0.5M枸橼酸调pH至3.5±0.2，蛋白浓度＜24 mg/ml，于 18～26℃下静置90 min，然后用2 M Tris调pH至6.5±0.3，除菌过滤2～8℃保存。
 
1.2.5.4 阳离子交换层析
将亲和收集液用阳离子平衡缓冲液（20 mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH 5.0）稀释≥5倍。采用Merck Fractogel EMD SO₃^-(M)填料，阳离子平衡缓冲液冲洗层析柱5CV，待基线平稳后调零上样，上样完毕后用阳离子洗脱缓冲液（A：20 mM醋酸-醋酸钠，pH 5.0和B：272 mM醋酸-醋酸钠，pH 5.9）分别洗脱，收集紫外280nm处主峰，收集液除菌过滤2～8℃保存。
 
1.2.5.5 阴离子交换层析
用2 M Tris调节阳离子收集液至pH 7.2±0.2。采用GE Q Sepharose Fast Flow填料，阴离子再生缓冲液（20 mM Tris-1M NaCl，pH 8.0）冲洗层析柱3CV，阴离子平衡缓冲液（20 mM Tris，pH 8.0）冲洗层析柱5CV，待基线平稳后调零上样，收集紫外280nm处主峰，收集液用2M枸橼酸调节pH至5.0～6.0，除菌过滤2～8℃保存。
 
1.2.5.6 超滤浓缩
采用millipore的Pellicon2超滤膜，用超滤平衡缓冲液（10 mM Tris-80 mM 醋酸钠，pH6.5）润洗系统后上样，连续换液浓缩至蛋白浓度为9～15mg/ml为止，收集液除菌过滤后2～8℃保存。
 
1.2.5.7 除病毒过滤
采用Millipore的VPF预过滤器和Viresolve Pro除病毒过滤膜包，用除病毒过滤缓冲液（10 mM Tris-80 M 醋酸钠，pH6.5）润洗膜包。收集过滤液，2～8℃保存。
 
1.2.5.8 原液制备
将超滤收集液，用工艺缓冲液（7.35 g/L枸橼酸钠，9 g/L氯化钠，35 g/L聚山梨酯80，pH6.5）按照1:49的体积比混合，混匀后除菌过滤，分装于储液袋中-30℃保存。