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BioWill?系列生物反应器生产贝伐珠单抗工艺探索

时间是:2021-10-13 02:25:00 点击次数:1632
 
1.1 工程细胞的制备
        将重组全人源抗CD20单克隆抗体基因转入宿主细胞(中国仓鼠卵巢细胞CHO-S),经过筛选、鉴定,得到重组工程细胞。细胞库的建立、传代及保存、细胞检定均符合《中国药典》现行版“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”的规定。
细胞复苏后于36.5℃、6% CO2、130 r/min条件下培养,细胞冻存1.5ml/支于液氮或-130℃以下保存。细胞外源因子检查应为阴性,细胞为圆形,悬浮生长,倍增时间为16~40 h;采用同工酶图谱分析和染色体特征分析,应与CHO细胞相同;细胞库应与CHO具体相同成瘤性特征;表达产物应有生物学活性;目的基因核苷酸序列应与理论设计序列一致。
 
1.2 原液的制备
 
1.2.1 细胞复苏与摇瓶种子扩增
 
从液氮罐中取出 1 支冻存的工作细胞库细胞, 37℃水浴复苏后,用种子培养基接种至摇瓶中,于 130 rpm、36.5℃、6% CO2 条件下培养,培养2~4天后进行细胞传代扩增,直至细胞数量满足WAVE培养的要求。
 
1.2.2 BioWill™Wave反应器种子培养
 
将摇瓶种子接种入种子培养基中,培养条件为36.5±0.5℃、摇动角度8º、摇动速度18 r/min、表通90~95%空气和10~5% CO2。当WAVE 反应器内细胞密度达到 2×106cells/mL~5×106cells/mL,活率90%以上时,进行 50 L 生物反应器接种。
 
1.2.3 BioWill™SUS50 L生物反应器种子培养
将wave种子接种入种子培养基中,培养条件为36.5±0.5℃、pH 7.0±0.1、DO 20%~80%、转速70~100 r/min。当反应器内细胞密度达到 2×106cells/mL~5×106cells/mL,活率90%以上时,进行下一步流加培养。
 
1. 2.4  BioWill™SUS 250 L生物反应器种子 流加培养
 
按照0.8~1.2×106cells/mL的密度接种,前期细胞生长期培养温度为36.5℃,搅拌速度70~150 r/min,DO 40%,pH 6.95±0.15,当细胞进入后期表达期时进行降温至33℃。
 
从培养第3天开始,将总量为初始培养体积20%的流加培养基进行连续性流加。每天取样,监测各培养参数和生化指标,当葡萄糖浓度低于2.5 g/L时,补加葡萄糖浓缩液使葡萄糖浓度提高至4 g/L。当泡沫高于液面5 cm时,补加消泡剂稀释液。细胞培养周期为 12~15天。
 
1.2.4 收获
 
待细胞培养结束后,收获上清液至下游纯化。
 
 
1.2.5  纯化
 
工艺流程图如下:
 
1.2.5.1 澄清过滤
      采用millipore的两级深层过滤膜包(D0HC和X0HC)以及Sartorius的除菌过滤器对收获液进行澄清过滤,过滤完成后用平衡缓冲液冲洗膜包。
1.2.5. 2 亲和层析
 
采用GE的Mabselect SuRe填料,用亲和平衡缓冲液(20mM Tris-150mM NaCl,pH 7.2)冲洗层析柱5CV,待基线平稳后调零上样,上样完毕后用亲和平衡缓冲液冲洗5CV;用亲和洗脱缓冲液(100mM枸橼酸-枸橼酸钠,pH 3.5)开始洗脱,收集紫外280nm处的主峰,收集液用2 M Tris调pH至6.5±0.3,除菌过滤2~8℃保存。
 
1.2.5.3 低pH病毒灭活
       将亲和收集液用0.5M枸橼酸调pH至3.5±0.2,蛋白浓度<24 mg/ml,于 18~26℃下静置90 min,然后用2 M Tris调pH至6.5±0.3,除菌过滤2~8℃保存。
 
1.2.5.4 阳离子交换层析
将亲和收集液用阳离子平衡缓冲液(20 mM枸橼酸-枸橼酸钠,pH 5.0)稀释≥5倍。采用Merck Fractogel EMD SO3-(M)填料,阳离子平衡缓冲液冲洗层析柱5CV,待基线平稳后调零上样,上样完毕后用阳离子洗脱缓冲液(A:20 mM醋酸-醋酸钠,pH 5.0和B:272 mM醋酸-醋酸钠,pH 5.9)分别洗脱,收集紫外280nm处主峰,收集液除菌过滤2~8℃保存。
 
1.2.5.5 阴离子交换层析
用2 M Tris调节阳离子收集液至pH 7.2±0.2。采用GE Q Sepharose Fast Flow填料,阴离子再生缓冲液(20 mM Tris-1M NaCl,pH 8.0)冲洗层析柱3CV,阴离子平衡缓冲液(20 mM Tris,pH 8.0)冲洗层析柱5CV,待基线平稳后调零上样,收集紫外280nm处主峰,收集液用2M枸橼酸调节pH至5.0~6.0,除菌过滤2~8℃保存。
 
1.2.5.6 超滤浓缩
采用millipore的Pellicon2超滤膜,用超滤平衡缓冲液(10 mM Tris-80 mM 醋酸钠,pH6.5)润洗系统后上样,连续换液浓缩至蛋白浓度为9~15mg/ml为止,收集液除菌过滤后2~8℃保存。
 
1.2.5.7 除病毒过滤
采用Millipore的VPF预过滤器和Viresolve Pro除病毒过滤膜包,用除病毒过滤缓冲液(10 mM Tris-80 M 醋酸钠,pH6.5)润洗膜包。收集过滤液,2~8℃保存。
 
1.2.5.8 原液制备
将超滤收集液,用工艺缓冲液(7.35 g/L枸橼酸钠,9 g/L氯化钠,35 g/L聚山梨酯80,pH6.5)按照1:49的体积比混合,混匀后除菌过滤,分装于储液袋中-30℃保存。
 

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