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细胞培养常见问题及回答

时间是:2021-10-15 06:25:00 点击次数:521
 
细胞培养常见问题及回答
 
1. 谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?
 
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终确定。L- 谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。
 
2. 什么培养基中可以省去加酚红?
 
酚红在培养基中被用来作为PH 值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。
 
3. 用台盼兰计数活细胞?
 
用无血清培养基把细胞悬液稀释到 200-2000 个/毫升,在 0.1 毫升的细胞中加入 0.1 毫升的 0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞。
 
4. 消除组织培养的污染?
 
当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母, 把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查 HEPA 过滤器。
 
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B 和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
 
(1) 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。
 
(2) 分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B 推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
 
(3) 每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。
 
(4) 确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度 2-3 倍浓度的抗生素的培养液培养细胞 2-3 代。
 
(5) 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
 
(6) 重复步骤 4。
 
(7) 在无抗生素的培养基中培养 4-6 代,确定污染是否以已被消除。
 
7. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?
 
GIBICO 的胎牛血清 没有预老化,储存在 2-8℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清,避免反复冻融。


8. 离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入 EDTA 的目的是什么? 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用 EDTA 清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。
 
10.胞培养的最适 PH 值和渗透压是多少?
 
生长培养基的PH 值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系, 在 PH 值 6.0-6.4 范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时,培养基的最适渗透压是 345-
380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式,减少技术问题,保持 PH 值和渗透压在以上所列的范围之内。
 

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